高GCh Twist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

本文刊于: 《中国医科大学学报》 年第期

关键词:
高GC hTwist 克隆 融合蛋白 原核表达

高GCh Twist融合蛋白载体构建及其表达条件优化
摘要
     目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法 以胃癌细胞系SGM 7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因hTwist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因hTwist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量hTwist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将hTwist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hTwist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的hTwist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC hTwist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论 上述策略的实施可以成功完成高GC hTwist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。


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